Epreuve d’enzymologie reposant sur l’ensemble des questions tombées ces cinq dernières années (2011 à 2015) en BTS Bioanalyses et contrôles sur le thème : kit « Acide L-Lactique » :

1) Le document 1 présente le kit Acide L-lactique. Réécrire la première réaction enzymatique ; Les formules semi-développées du substrat et du produit sont exigées :

2) Définissez les fonctions organiques portées par les carbones N°2 du substrat et du produit et en déduire le type de réaction réalisée :

3) Donnez les noms (non abrégés) de l’enzyme et du coenzyme impliqués dans ce document N°1 :

4) A  quelle classe enzymatique appartient cette enzyme. Donnez le premier chiffre du code international de ce type d’enzyme :

5) Cette enzyme présente une grande spécificité  de catalyse. Définir les termes de spécificité et d’affinité ; Puis précisez la spécificité de la L-LDH :

6) La première réaction du kit est-elle une réaction  indicatrice : Justifiez. A quoi sert la seconde réaction du kit ?

7) Si l’on suit l’absorbance à 340nm en fonction du temps, dès l’instant où l’on rajoute le réactif R4, on observe la courbe présentée dans le document 2.
Déterminez l’expression littérale de l’activité catalytique de l’enzyme en katal :

8) Le petit flacon du réactif R4 est étiqueté : «  L-LDH : 105 mkat.L^-1 ». A quelle grandeur correspond cette valeur donnée en mkat.L^-1 ?
Redémontrez, d’après le document 1, comment cette valeur est obtenue :

9) Pour déterminer les paramètres cinétiques ( KM et v_max ) de la L-LDH, on utilisera la représentation graphique en double inverse de Lineweaver-Burk (LB). Redémontrez cette relation LB à partir de l’équation de Michaelis-Menten (MM) :

10) Pour déterminer expérimentalement les paramètres cinétiques (KM et v_max) de la L-LDH, on utilise le kit présenté dans le document 1.
On mesure l’apparition du NADH en fonction du temps pour différentes concentration en acide lactique.
Les résultats obtenus sont représentés graphiquement, en double inverse :
1/vi =1/[Ac. lactique]_MR          dans le document 3.
Tout en justifiant, déterminez KM et v_max de la L-LDH :

11) La LDH est une isoenzyme. Rappelez la définition du terme isoenzyme.
Deux autres isoenzymes de la LDH ont des v_max et des KM différents ; A l’aide du tableau ci-dessous, définissez, tout en justifiant, quelle isoenzyme est la plus efficace :

 

12) La LDH est une enzyme oligomérique. Après avoir expliqué le terme « oligomérique », expliquez la différence entre une enzyme oligomérique et un complexe multienzymatique :

13) L’enzyme L-LDH est susceptible d’être inhibée. Nommer et décrire deux principaux types d’inhibition enzymatique …
… Sera attendu : le diagramme réactionnel, le schéma Enzyme inhibiteur Substrat, et le graphique schématisé en Lineweaver Burk en présence et en absence de l’inhibiteur :

14) La cinétique de la L-LDH semble être influencée par l’oxalate.
D’après l’étude du document 4, interprétez, tout en justifiant, l’effet de l’oxalate sur la L-LDH et donnez la valeur du nouveau paramètre :

15) Calculer le Ki de la L-LDH vis-à-vis de l’oxalate :
         Donnée : Le nouveau paramètre cinétique a varié d’un facteur :
                                      (  1  +  [ oxalate ]  )
                                                       Ki

16) Certaines enzymes oligomériques ne présentent pas de cinétique Michaelienne (cinétique suivant la réaction de Michaelis-Menten).
a) Dans ce cas, quel type de cinétique suivent ces enzymes ?
b) Décrire l’effet de la fixation d’un substrat sur un des sites actifs de ce type d’enzyme ?
c) Représentez l’allure de la courbe vi=f ( [ S ] ) en absence et en présence d’un effecteur activateur sur ce type d’enzyme.
d) Comment se nomme ce type de courbe ?

17) Le réactif R3 du kit acide L-lactique (Document 1) est livré en poudre dans son flacon. Selon les informations inscrites sur cette notice, donnez le développement aboutissant à la formule littérale de la masse de réactif R3 qu’il faudrait peser pour préparer :
Venz=100mL de l’enzyme GPT à b=76,40µkat.L_enz^-1 ; Puis réalisez le calcul.

18) Rappelez quelles sont les conditions opératoires généralement respectées pour la détermination d’une activité enzymatique ; Puis évaluez si cette condition est validée vis-à-vis du NAD⁺.
Données :   M_NAD+=663,4g.mol^-1
                               KM_{LDH  /  NAD+}=0,01mmol.L^-1

19) Le kit « Acide L-lactique » (Document 1) permet de doser l’acide lactique. De quelle méthode de dosage de substrat s’agit-il ? Justifiez la réponse :

20) Les mesures d’absorbance se feront contre l’eau ou l’air (document 1). On mesurera les DO1et DO2 de l’échantillon mais aussi du « blanc ».
Donnez la composition volumique de ce blanc réactif :

21) A l’aide du kit « Acide L-lactique » (Document 1), on détermine la concentration en acide lactique en mesurant quatre absorbances.
Au final, on nous dit : r_{Acide_lactique} = F x DDO 
Comment obtient-on  DDO ?

22) Le document 1 nous donne la formule littérale de la concentration massique en acide L-lactique de l’échantillon en fonction de DDo :
r_{Ac_lactique_Ech} = F x DDo ;
Le facteur F multiplicateur de la variation d’absorbance est de 0,32.
Retrouvez, tout en justifiant, le calcul permettant d’obtenir cette valeur :
Donnée : e_{NADH, H+} = 6,3 L.mmol^-1.cm^-1

23) Pour réaliser ce kit « Acide L-Lactique », la société BioSentec a ses propres protocoles de purification des enzymes. La L-LDH est produite en fermenteur par une bactérie génétiquement modifiée.
L’extrait brut récupéré du fermenteur va subir trois méthodes séparatives pour aboutir à l’extrait purifié de la L-LDH.
A l’aide des données ci-dessous, calculez le rendement et l’enrichissement de cette purification :